Javascript is momenteel uitgeschakeld in uw browser.Verschillende functies van deze site werken niet als javascript is uitgeschakeld.open toegang tot wetenschappelijk en medisch onderzoekVan indiening tot eerste redactionele beslissing.Van redactionele acceptatie tot publicatie.Bovenstaand percentage manuscripten is in de afgelopen 12 maanden afgewezen.Open access peer-reviewed wetenschappelijke en medische tijdschriften.Dove Medical Press is lid van de OAI.Bulk herdrukken voor de farmaceutische industrie.We bieden onze auteurs echte voordelen, waaronder een snelle verwerking van papers.Registreer uw specifieke gegevens en specifieke geneesmiddelen die u interesseren en we zullen de informatie die u verstrekt koppelen aan artikelen uit onze uitgebreide database en pdf-kopieën onmiddellijk naar u e-mailen.Terug naar tijdschriften » Geneesmiddelontwerp, -ontwikkeling en -therapie » Volume 11Auteurs Slastnikova TA , Rosenkranz AA , Khramtsov YV , Karyagina TS , Ovechko SA , Sobolev ASGepubliceerd 26 april 2017 Jaargang 2017:11 Pagina's 1315—1334DOI https://doi.org/10.2147/DDDT.S127270Beoordeling door enkele anonieme peer reviewRedacteur die publicatie heeft goedgekeurd: Dr James JanetkaTatiana A Slastnikova,1 Andrey A Rosenkranz,1,2 Yuri V Khramtsov,1 Tatiana S Karyagina,1 Sergey A Ovechko,2 Alexander S Sobolev1,2 1Laboratorium voor moleculaire genetica van intracellulair transport, Instituut voor genbiologie, Russische Academie van Wetenschappen, 2Departement Biofysica, Faculteit Biologie, Lomonosov Staatsuniversiteit van Moskou, Moskou, Rusland Doel: Modulaire nanotransporters (MNT's) zijn kunstmatige multifunctionele systemen die zijn ontworpen om receptorspecifiek transport van het celoppervlak naar de celkern te vergemakkelijken door opname van polypeptidedomeinen voor het bereiken van receptor binding en internalisatie, evenals opeenvolgende endosomale ontsnapping en nucleaire translocatie.Het doel van deze studie was om een ​​nieuwe MNT te ontwikkelen die gericht is op folaatreceptoren (FR's) voor nauwkeurige levering van therapeutische lading aan de kernen van FR-positieve cellen en om het potentieel ervan te evalueren, met name voor de levering van therapeutische middelen (bijv. het Auger-elektron emitter 111In) in de kernen van doelkankercellen.Methoden: Een FR-gerichte MNT werd ontwikkeld door plaatsspecifieke derivatisering van ligandvrij MNT met maleïmide-polyethyleenglycol-foliumzuur.Het vermogen van FR-gerichte MNT om te accumuleren in doel-FR tot expressie brengende cellen werd geëvalueerd met behulp van flowcytometrie, en de intracellulaire lokalisatie van deze MNT werd beoordeeld met behulp van confocale laser scanning microscopie van cellen.De cytotoxiciteit van de 111In-gelabelde FR-gerichte MNT werd geëvalueerd op HeLa- en U87MG-kankercellijnen die FR tot expressie brengen.In vivo micro-single-photon emissie computertomografie/CT-beeldvorming en antitumor werkzaamheidsstudies werden uitgevoerd met intratumorale injectie van 111In-gelabelde FR-gerichte MNT in HeLa xenograft-dragende muizen.Resultaten: De resulterende FR-gerichte MNT accumuleerde specifiek in FR-positieve HeLa-kankercellijnen en toonde het vermogen om zijn doelbestemming te bereiken - de celkernen.111In-gelabelde FR-gerichte MNT toonde efficiënte en specifieke FR-positieve uitroeiing van kankercellen.Een in vivo HeLa-xenotransplantaatmodel onthulde langdurige retentie van 111In, afgeleverd door FR-gerichte MNT en significante vertraging van de tumorgroei (tot 80% groeiremming).Conclusie: De op FR gerichte MNT voldeed aan de verwachtingen van zijn vermogen om actieve lading efficiënt en specifiek in de kernen van doel-FR-positieve cellen te brengen.Als gevolg van deze bevinding verdient de nieuwe FR-gerichte MNT-aanpak een brede evaluatie.Sleutelwoorden: nucleaire levering, foliumzuur, kanker, radionuclidetherapie, indium-111Therapeutische systemen die worden ontwikkeld om zich met een therapeutisch middel op abnormale (bijv. kanker) cellen te richten, hebben hoge laesie-selectiviteitseigenschappen nodig om de gespecificeerde cellen te "vinden", terwijl normale cellen efficiënt worden gespaard.Een veelbelovende benadering om hierin te voorzien is het gebruik van laesie-specifieke oppervlaktecelreceptoren of antigenen als doelwit voor therapieën.1 Folaatreceptoren (FR's), die vaak tot overexpressie worden gebracht en toegankelijk zijn voor bloedcirculatiemiddelen, hetzij bij kwaadaardige transformatie van de cel of bij activering van macrofagen, in tegenstelling tot hun verwaarloosbare blootstelling aan de bloedpool in normale weefsels en niet-geactiveerde macrofagen, behoren tot de bekendste en meest erkende typen van deze doelantigenen; 1-4 FR's zijn potentiële oppervlaktereceptoren voor het richten van talrijke ziekten, voornamelijk verschillende soorten kanker en een brede groep van significante ontstekingsaandoeningen, waaronder, maar niet beperkt tot, reumatoïde artritis,5,6 atherosclerose,7 de ziekte van Crohn,8 en enkele andere aandoeningen.Er is een cohort van therapeutische middelen (DNA; Auger-elektronenstralers en alfastralers die ioniserende deeltjes met hoge lineaire energieoverdracht [LET] op korte afstand produceren; fotosensibilisatoren, die voornamelijk reactieve zuurstofsoorten produceren, enz.) die (of op zijn minst zeer "verlangend" zijn) ) niet alleen gericht op de gespecificeerde abnormale cellen, maar ook verdere afgifte in het subcellulaire doelcompartiment, waar hun maximale therapeutische werkzaamheid kan worden bereikt.9,10 Om meer specifiek te zijn, zullen we Auger-elektronenemitters als een voorbeeld beschouwen: Auger-elektronen uitgezonden door meest algemeen erkende Auger-elektronenemitters (125I, 123I, 67Ga, 111In) die in de klinische praktijk worden gebruikt, worden gekenmerkt door weefselpadlengtes van <50 nm (Figuur 1A), waardoor hun celdodende werkzaamheid kritisch afhankelijk is van de exacte plaats van verval binnenin de cel.11 Wanneer de plaats van verval wordt verschoven van het celoppervlak naar de kern, is berekend dat de energiedepositie in stralingsgevoelig DNA tot 30 keer toeneemt (Figuur 1A).12 Bovendien zou de cytotoxiciteit meer dan 100-voudig kunnen toenemen wanneer de vervalplaats zich in de nabijheid van nucleair DNA bevindt.13 Een mogelijke manier om targeting op subcellulair niveau te implementeren, is door gebruik te maken van natuurlijke intracellulaire transportroutes.9,10 Figuur 1 demonstreert de voordelen van deze doelgerichte leveringsaanpak.Een veelbelovend medicijnafgiftesysteem dat deze strategie rekruteert, is de modulaire nanotransporters (MNT's)-benadering, recombinante moleculen bestaande uit domeinen (kunstmatige modules) voor het bereiken van receptorbinding en internalisatie, evenals endosomale ontsnapping en nucleaire translocatie, waardoor de levering van medicijnen uit de celoppervlak naar de kern (Figuur 1B).14 Deze 'slimme' vehikels die zich richten op ofwel epidermale groeifactorreceptor (EGFR) ofwel kankercellen die melanocortine-1-receptor tot overexpressie brengen, hebben hun potentiële bruikbaarheid al bewezen voor het afleveren van verschillende therapeutische middelen, waaronder fotosensitizers15-17 en radionucliden die hoge LET-deeltjes uitzenden, 18-20, aangezien werd aangetoond dat ze in vitro lokaliseren in de kernen van doelkankercellen (tot 60% geïnternaliseerd gevonden in kernen)15,16,18,20 en in vivo,17 evenals de cytotoxiciteit van deze bovengenoemde ladingen in vitro aanzienlijk verbeteren15,16,18,20 en het therapeutisch potentieel van verschillende fotosensitizers17 enAuger elektronenemitter 111In21 in vivo.Bovendien is eerder een veelvoudig voordeel aangetoond van MNT op ware grootte ten opzichte van MNT's zonder functionele modules voor de afgifte van cytotoxische geneesmiddelen.15,16Figuur 1 Schematische weergave van de benadering van de gerichte levering met behulp van gerichte intranucleaire afgifte van cytotoxische geneesmiddelen (hier Auger-elektronenemitter 111In) door op folaatreceptor gerichte MNT.Opmerkingen: (A) Auger-elektronenbereik en de efficiëntie van Auger-elektronenemitters die zich binnen en buiten de cel bevinden.(B) MNT-modulefuncties.Afkortingen: DTox, difterietoxine translocatiedomein;FA, foliumzuur;MNT's, modulaire nanotransporters;NLS, nucleaire lokalisatiesequentie;PEG, polyethyleenglycol.Aangezien de uitwisselbare aard van de modules binnen MNT het gebruik van bijna elk targeting-ligand mogelijk maakt, lijkt een MNT-concept in combinatie met FR-targeting een veelbelovende nieuwe benadering voor de behandeling van talrijke ziekten die worden gekenmerkt door FR-overexpressie.Het doel van de huidige studie was om een ​​nieuwe effectieve MNT te ontwikkelen die specifiek is voor FR voor gerichte levering van therapeutische lading aan de kernen van FR-positieve cellen en om het potentieel voor gebruik van therapeutische middelen te evalueren.De Auger-elektronenzender 111In werd als voorbeeld gebruikt vanwege het veelbelovende therapeutisch potentieel en de klinische acceptatie voor diagnostiek.Het belangrijkste schema van de ontwikkeling van FR-gerichte MNT en de etikettering ervan met 111In wordt weergegeven in figuur 2.Figuur 2 Ontwikkeling van FR-gerichte MNT (MNT-PEG-FA).Opmerkingen: (A) Schematische weergave van MNT-derivatisering met FA-groep met een SDS-PAGE-gel onder niet-reducerende omstandigheden van MNT en de resulterende FR-gerichte MNT-PEG-FA.(B) Schematische presentatie van MNT-PEG-FA-labeling met Auger-elektronenemitter 111In met autoradiografie van SDS-PAGE-gels van 111In-MNT-PEG-FA.Labels aan de linkerkant geven de banden van ColorBurst™ Electrophoresis Markers aan.Afkortingen: DTox, difterietoxine translocatiedomein;FA, foliumzuur;HMP, hemoglobine-achtig eiwit van E. coli;MNT's, modulaire nanotransporters;NLS, nucleaire lokalisatiesequentie;PEG, polyethyleenglycol;SDS-PAGE, natriumdodecylsulfaat polyacrylamidegelelektroforese.Humaan cervicaal carcinoom HeLa-cellen werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Prof. E Sverdlov, Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moskou, Rusland.Menselijke glioom U87MG-cellen werden vriendelijk verstrekt door Dr. Darell Bigner, Duke University Medical Center, Durham, NC, VS.Het gebruik van deze cellijnen werd goedgekeurd door de Moscow State University Commission on Bioethics.De cellen werden gekweekt in interne folaatdeficiënte media aangevuld met zowel 10% kalfsfoetaal serum (CVS) als gentamicine (50 mg/L, Dalhimpharm, Khabarovsk, Rusland) bij 37°C in een 5% CO2-atmosfeer.Folaatreceptor-gerichte modulaire nanotransporter (MNT)FR-gerichte MNT werd gemaakt door foliumzuur (FA) polyethyleenglycol (PEG) maleïmide (FA-PEG-Mal, NanoCs, New York, NY, VS) of vrije FA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) te bevestigen ) aan een polypeptide bestaande uit het difterietoxine-translocatiedomein als een endosomolytische module, de geoptimaliseerde nucleaire lokalisatiesequentie van SV-40 groot T-antigeen en hemoglobine-achtig eiwit van Escherichia coli HMP als een dragermodule;echter ontbreekt een ligandmodule die is bereid zoals eerder vermeld.17 In het kort werd ligandvrij MNT tot expressie gebracht in E. coli-suspensie (optische dichtheid [OD]550: 0,6–1,0) door toevoeging van isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside tot een eindconcentratie van 200 M bij +18°C en schudden van 170-180 rpm gedurende 2 uur.De bacteriecellen werden gepelleteerd door centrifugeren bij 10.000 rpm in een JA-10-rotor (Beckman, Brea, CA, VS) bij +4 ° C gedurende 30 minuten, daarna werden de pellets ingevroren voor daaropvolgende lyse in ijskoude 50 mM natriumfosfaat , 300 mM NaCl, pH 8,0, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 5 mg/ml lysozym en 0,5% Triton X-100.Het resulterende lysaat werd geklaard door centrifugeren bij 18.000 rpm in een JA-20 rotor (Beckman) bij +4°C gedurende 30 minuten, daarna werd het supernatant geladen op een Ni-NTA agarosekolom (QIAGEN, Venlo, Nederland), gewassen met 50 mM natriumfosfaat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 1% glycerol, gevolgd door 50 mM natriumfosfaat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8,0.De MNT's werden geëlueerd met 50 mM natriumfosfaat, 300 mM NaCl, 700 mM imidazool, pH 8,0, en gedialyseerd tegen 10 mM natriumfosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,4.De eerste variant van FR-gerichte MNT-FA werd gesynthetiseerd door chemische hechting van FA aan ligandvrij MNT volgens een eerder beschreven protocol voor FA-hechting aan albumine.22 In het kort werd FA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opgelost in dimethylsulfoxide tot 0,1 M en geïncubeerd met een 1,2-voudige molaire overmaat 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT), gevolgd door toevoeging van N-hydroxysuccinimide (NHS) in 1,2-voudige molaire overmaat.Na 4 uur incubatie bij kamertemperatuur werd een 15-voudige molaire overmaat van de "geactiveerde" FA toegevoegd aan de ligandvrije MNT-oplossing en gedurende 12 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd.Het ongeconjugeerde FA evenals de bijproducten van de reactie werden verwijderd door vijf cycli van ultrafiltratie op Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Ultracel-30K, Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Ierland), wat gezuiverd MNT-FA opleverde.De FA:MNT-verhouding in het resulterende MNT-FA werd spectrofotometrisch geschat (zie details hieronder).Om de tweede FR-gerichte MNT-variant (Figuur 2) te verkrijgen die plaatsspecifieke modificatie vereist met 3,4 kDa FA-PEG-Mal, hebben we gezocht naar optimale omstandigheden voor deze reactie, waardoor een redelijke modificatie van MNT met FR-targeting ligand werd verkregen.De variabelen omvatten: het gebruikte sulfhydryl (SH)-reducerende middel (tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride [TCEP] of 1,4-dithiothreitol [DTT]);TCEP-concentratie en FA-PEG-Mal/MNT-verhouding in het reactiemengsel.In onze allereerste stap van optimalisatie van het conjugatieprotocol hebben we model NH2-PEG-Mal gebruikt in plaats van FA-PEG-Mal.Het geoptimaliseerde protocol voor MNT-labeling dat volgt, werd gebruikt voor volgende experimenten.In een typische procedure werd vers bereide 100 mM TCEP-oplossing (pH 7,0) toegevoegd aan MNT-oplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 2,5 mg/mL, 33 M) tot een eindconcentratie van TCEP van 3 mM.Dit mengsel werd gedurende 40 minuten bij 37°C geïncubeerd om SH-groepen in het MNT-molecuul te verminderen (in totaal drie SH-groepen).Het mengsel werd gedialyseerd tegen PBS met 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; pH 7,3) om de TCEP-concentratie te verlagen tot 8,2 uM;vervolgens werd vers bereide FA-PEG-Mal-oplossing in PBS met EDTA toegevoegd aan gereduceerd MNT in een 50-voudige molaire overmaat tot MNT.Het reactiemengsel werd een nacht bij +4°C onder voorzichtig mengen geïncubeerd.Het resulterende MNT met FA-PEG-Mal (MNT-PEG-FA) werd gezuiverd uit niet-gereageerd FA-PEG-Mal evenals reactiebijproducten door vijf cycli van ultrafiltratie met behulp van Amicon Ultracel-30K.De opbrengst van de FA-PEG-Mal-conjugatiereactie (het percentage MNT-moleculen gemodificeerd met FA-PEG-Mal) werd berekend met twee verschillende methoden.De eerste werd uitgevoerd door analyse van niet-reducerende natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) met behulp van ImageQuant TL 5.0-software (Bio-Rad, Hercules, CA, VS), waarbij het percentage banden werd berekend dat overeenkomt met intacte MNT (70 kDa) en MNT gederivatiseerd met één (73,5 kDa), twee (77 kDa) of drie (80,5 kDa) Mal-PEG-FA.De tweede methode maakte gebruik van spectrofotometrische bepaling.In detail werd de absorptie van Mal-PEG-FA geconjugeerd MNT bepaald bij λ = 367 nm, en de concentratie van FA werd berekend met behulp van de wet van Beer-Lambert en de eerder bepaalde extinctiecoëfficiënt van FA in carbonaatbuffer met 5 mM EDTA, pH 8,6, waarbij de sondes werden verdund voor spectroscopie (-367 nm = 11.000 M-1cm-1), gecorrigeerd voor MNT-absorptie bij λ = 367 nm.De eiwitconcentratie (MNT) werd bepaald met behulp van de Bradford-eiwittest.Controle MNT-PEG zonder FA-ligand werd op dezelfde manier bereid met Mal-PEG-amine (Mw 5 kDa; Creative PEGWorks, Chapel Hill, NC, VS).Conjugatie van Alexa Fluor 647 tot MNT-PEG-FA en MNT-PEGVers bereide oplossing van Alexa Fluor 647 succinimidylester (Molecular Probes, Eugene, OR, VS) (2 mg / ml) werd toegevoegd aan MNT-PEG-FA of MNT-PEG-oplossing (2,5 mg / ml) in carbonaatbuffer, pH 8,6, in 5:1 molaire overmaat.Het reactiemengsel werd een nacht bij +4°C onder voorzichtig mengen geïncubeerd.Het resulterende MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 werd gezuiverd uit niet-gereageerde Alexa647 evenals reactiebijproducten door vijf cycli van ultrafiltratie met behulp van Amicon Ultracel-30K.De gemiddelde hoeveelheid Alexa Fluor 647-moleculen geconjugeerd aan MNT-PEG-FA- of MNT-PEG-moleculen werd spectrofotometrisch bepaald.In detail werd de absorptie van MNT's geconjugeerd met Alexa Fluor 647 bepaald bij λ = 650 nm, en de concentratie van Alexa Fluor 647 werd berekend met behulp van de wet van Beer-Lambert en de extinctiecoëfficiënt van Alexa Fluor 647 650 nm = 270.000 M−1cm −1.De eiwitconcentratie (MNT's) werd bepaald met behulp van de Bradford-eiwittest.Flowcytometriestudies van MNT-PEG-FA-Alexa647 internalisatie in FR-positieve cellenHeLa (FR-positief) of A549 (ATCC® CCL-185 ™, FR-negatief) cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes (4-9 x 104 cellen / putje).De volgende dag werd het medium vervangen door vers medium dat 1% runderserumalbumine (BSA) bevatte.Vervolgens werden MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 aan de putjes toegevoegd (drie tot zes per punt) tot een eindconcentratie van 50 nM, en de cellen werden 24 of 48 uur bij 37°C geïncubeerd. in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer.Daarna werd medium dat ongebonden MNT's bevatte verwijderd en werden de cellen driemaal gewassen, getrypsiniseerd, geoogst in Eppendorf-buisjes en gedurende 10 minuten bij 200 rpm gecentrifugeerd.Het supernatant dat MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 bevat, losgemaakt door trypsine van het celoppervlak, werd weggegooid en de resterende celpellet die alleen een geïnternaliseerde fractie van MNT-PEG-FA-Alexa647 bevatte, werd opgelost in Hanks-oplossing met 1 % BSA en geanalyseerd door flowcytometrie met behulp van een Epics Altra Flow Cytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, VS).De Alexa Fluor 647-kleurstof werd geëxciteerd bij 633 nm en emissie werd gedetecteerd bij 675 nm.Per monster werden in totaal 0,5-1 × 104 gated events verzameld.Om de niet-specifieke opname te beoordelen, werden parallelle putjes (drie tot zes per elk punt) met FA-bevattende media (1 mM) op dezelfde manier verwerkt.Om celautofluorescentie te bepalen, werd de toevoeging van MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 weggelaten en werden de putjes op dezelfde manier verwerkt.Confocale laser scanning microscopie beeldvorming van FR-positieve levende cellen na incubatie met MNT-PEG-FA-Alexa647HeLa (FR-positief) of A549 (FR-negatief) cellen werden gezaaid op dekglaasjes in platen met 24 putjes (4-9 x 104 cellen / putje).De volgende dag werd het medium veranderd in vers medium dat 1% BSA bevatte.Vervolgens werd MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 aan de putjes toegevoegd tot de eindconcentratie van 50 nM, en werden de cellen 48 uur bij 37°C in een met 5% CO2 bevochtigde atmosfeer geïncubeerd.Daarna werd het medium met ongebonden MNT's verwijderd en werden de cellen vier keer gewassen met Hanks-oplossing gevolgd door aceton-methanol (1:1) fixatie gedurende 30 minuten bij -40°C.Vervolgens werden de cellen aan de lucht gedroogd en werd de plaat goed gesloten en bewaard bij -40°C tot beeldvorming.Voorafgaand aan beeldvorming werden de cellen gedurende 35 minuten bij 37 ° C gepermeabiliseerd in PBS met 0,1% Tween-20 en 0,2% Triton X-100 en vervolgens gekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (Sigma) en gemonteerd op een glazen microscoopglaasje met behulp van Shandon Immu-mount montagemedium (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, VS).Subcellulaire lokalisatie werd onderzocht met behulp van een LSM 510 META NLO multiphoton laser scanning microscoop (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland) uitgerust met een Mai Tai Broadband Mode-Locked Ti-sapphire Laser (Spectra-Physics, Mountain View, CA, VS) met Plan- Apochromat × 63/1.4 Olie DIC-lens.DAPI-fluorescentie was twee-foton geëxciteerd met een Ti-saffierlaser (790 nm), terwijl Alexa Fluor 647-fluorescentie werd geregistreerd bij 633 nm-excitatie en 650-710 doorlaatband voor emissie.Om niet-specifieke opname te beoordelen, werden parallelle putjes met dekglaasjes met FA-bevattend medium (1 mM) op dezelfde manier verwerkt.Om celautofluorescentie te bepalen, werd de toevoeging van MNT-PEG-FA-Alexa647 of MNT-PEG-Alexa647 weggelaten en werden de dekglaasjes op dezelfde manier verwerkt.Etikettering van MNT-PEG-FA en MNT-FA met 111InConjugatie van p-SCN-Bn-NOTA aan MNT'sOm daaropvolgende 111In-labeling mogelijk te maken, werd de chelator p-SCN-Bn-NOTA (Macrocyclics, Plano, TX, VS) (log KIn3+NOTA =26,2)23 geconjugeerd aan MNT-PEG-FA en MNT-FA volgens een recent gepubliceerde protocol.18 In het kort werd 1 mg MNT-FA of 4-8 mg MNT-PEG-FA geïncubeerd met een 10-voudige molaire overmaat van de chelator in 1 x pH 8,6 conjugatiebuffer18 gedurende 20 uur bij kamertemperatuur met eindconcentraties van MNT ≥1,5 mg/ml.Het chelator-MNT-conjugaat werd geconcentreerd en van de overmaat aan chelator gescheiden door vijf cycli van ultrafiltratie met behulp van Amicon Ultracel-30K.Tijdens dit proces werd de conjugatiebuffer geleidelijk vervangen door 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), 15 mM NaCl, pH 7,4.Alle buffers die werden gebruikt voor chelatorconjugatie en labelingsprocedures werden door Chelex-100-hars (200-400 mesh; Bio-Rad) geleid om onvoorziene metaalioncontaminatie te minimaliseren.Etikettering van MNT-conjugaten met 111InNOTA-MNT-PEG-FA of NOTA-MNT-FA (0,12 mg) in 10 mM HEPES, 15 mM NaCl, pH 7,5, werd gemengd met 29 L 1 M HEPES, pH 7,5, 21 μL 0,1 M citraat, pH 6,7, 8 L 1% SDS en 42 μL 0,25 M HCl (Ultrapure Grade, Merck, Darmstadt, Duitsland);vervolgens werd 102 μL (322 MBq) 111InCl3 (Federal Center of Nuclear Medicine Projects Design and Development, Moskou, Rusland) in 0,048 M HCl toegevoegd.Het reactiemengsel werd gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd en vervolgens werd de reactie gestopt door toevoeging van 3 L 0,05 M EDTA, pH 8,0, gevolgd door voorzichtig mengen en incubatie gedurende 10 minuten bij 37°C.Ten slotte werd de pH geneutraliseerd met 24 L 1 M NaOH.De initiële specifieke radioactiviteit van ofwel FR-gerichte 111In-MNT, verkregen met behulp van dit protocol, was 2,7 GBq/mg.Als controle werd 111In behandeld volgens dezelfde procedures, behalve dat de NOTA-MNT in het reactiemengsel werd weggelaten.Radiochemische opbrengsten en 111In-MNT-PEG-FA en 111In-MNT-FA integriteit werden geanalyseerd door Laemmli SDS-PAGE met behulp van Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (Bio-Rad) met daaropvolgende detectie van radioactiviteit op een storm 865 fosforimager (GE Healthcare, Uppsala, Zweden).De beelden werden geanalyseerd met behulp van ImageQuant TL 5.0-software (Bio-Rad).Vanwege de hoge (96+%) radiochemische labelingsopbrengsten was er geen noodzaak voor enige daaropvolgende zuivering van 111In-gelabelde MNT's.HeLa- en U87MG-cellen werden gezaaid in platen met 24 putjes (2, 5 x 104 cellen / putje).Twee dagen later werd het medium ververst en verdunningen van 111In-MNT-PEG-FA (0-25 MBq/ml; 0-11 g/ml), of 111In-MNT-FA (0-20 MBq/ml), of de controle 111In-oplossing die (0-25 MBq/ml) of niet-gelabelde NOTA-MNT-PEG-FA (0-11 μg/ml) bevatte, werd toegevoegd.Voor FA-competitiestudies werd 500 M FA toegevoegd aan de HeLa-cellen voorafgaand aan de toevoeging van 111In-MNT-PEG-FA of controle 111In.De cellen werden 48 uur geïncubeerd in een bevochtigde atmosfeer bij 37°C in 5% CO2.Vervolgens werd medium met ongebonden radioactiviteit verwijderd en werden de cellen gewassen, getrypsiniseerd, geoogst en opnieuw gesuspendeerd in 1 ml vers medium.De cellen werden gezaaid voor kolonievormende test in kolven van 25 cm2 (2.000 cellen per kolf) in DMEM/F12 aangevuld met 10% CVS.Na 6-11 dagen werden de kolonies gekleurd met Crystal Violet en geteld.Deze experimenten werden uitgevoerd op 8-10 weken oude vrouwelijke Balb / c nu / nu-muizen (Institute of Bioorganic Chemistry Regional Affiliate, Russian Academy of Science, Pushchino, Rusland).De dieren werden gehouden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden met toegang tot muizenvoer en water ad libitum.Vanaf 10 dagen voorafgaand aan single-photon emissie computertomografie (SPECT)/CT-beeldvorming of therapie en tot 2 weken na aanvang van het experiment werden de muizen gevoed met FA-deficiënt dieet TD.00434 (Envigo, Huntingdon, VK) .Het experimentele protocol werd goedgekeurd door de Institute Commission for Animals en werd uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.HeLa-tumoren werden vastgesteld in naakte muizen door subcutane injectie van 107 cellen gesuspendeerd in 100 L serumvrij medium in het achterste flankgebied.SPECT/CT-beeldvorming en therapieonderzoeken werden 12 dagen na tumorinoculatie gestart.Voor SPECT/CT-beeldvorming werden HeLa xenograft-dragende muizen verdoofd met 0,8%-1,8% isofluraan in lucht;tumordragende muizen (n=3) kregen intratumorale injecties van 15 MBq van ofwel 111In-MNT-PEG-FA of controle 111In in Hanks-oplossing in een volume gelijk aan de helft van het tumorvolume.Beeldvorming van het hele lichaam werd uitgevoerd op een U-SPECT-II/CT (MILabs, Utrecht, Nederland) scanner onmiddellijk na injectie en voortgezet gedurende 5×10 minuten frames met behulp van een 1,0 mm-diameter pinhole collimator, met daaropvolgend onmiddellijk geheel -dier CT acquisitie.Aanvullende SPECT / CT-beeldvorming werd uitgevoerd tijdens de daaropvolgende dagen (3-5 frames × 10 min).De beelden werden gereconstrueerd met behulp van U-SPECT-Rec2.34b-software verkregen van de fabrikant, gevolgd door co-registratie van SPECT-beelden op de overeenkomstige CT-beelden.Kwantitatieve analyse van afbeeldingen na driedimensionale (3D)-reconstructie werd uitgevoerd met behulp van PMOD 3.4-software (PMOD Technologies Ltd., Zürich, Zwitserland).De radioactiviteitsconcentratie in tumor en andere organen of weefsels werd bepaald door enkele bolletjes binnen het orgaan of weefsel van belang te selecteren, gevolgd door deling van het samengevatte signaal binnen deze bol door zijn volume.Voor therapiestudies werden HeLa-xenotransplantaatdragende muizen (n=4-5) intratumoraal geïnjecteerd met 7,5 MBq/3,5 g (alleen 111In-MNT-PEG-FA), of 15 MBq/7,1 μg van ofwel 111In-MNT-PEG- FA, of controle 111In of niet-gelabeld NOTA-MNT-PEG-FA in een volume gelijk aan de helft van het tumorvolume.De werkzaamheid van de behandeling werd gevolgd met behulp van de tumorgroeiremmingsindex24 gedefinieerd als: (1 [gemiddeld volume van behandelde tumoren]/[gemiddeld volume van controletumoren]) × 100%.De dieren werden geëuthanaseerd wanneer het tumorvolume de 2.000 mm3 overschreed of bij het teken van dierenonrust.De gegevens werden geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism 5-software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, VS).Gegevens op de plots vertegenwoordigen gemiddelde waarden, met balken die de standaardfout van het gemiddelde van 3-6 repetitieve waarden aangeven.De significantie van het verschil werd geëvalueerd met behulp van de Kruskal-Wallis- of F-test of log-rank-test.Ligand-vrij MNT werd tot expressie gebracht en met succes gezuiverd tot 90+% zuiverheid (Figuur 2A).Voor onze eerste stappen hebben we FA rechtstreeks geconjugeerd via NHS en EDC volgens een eerder gepubliceerd protocol, 22 wat MNT-FA opleverde met een FA: MNT molaire verhouding van 1,6, die spectrofotometrisch werd bepaald door absorptie bij 367 nm met daaropvolgende correctie voor eiwit absorptie bij deze golflengte.Om de eigenschappen van het eindproduct te verbeteren, schakelden we vervolgens over op plaatsspecifieke hechting van FA-PEG-Mal-verbinding aan SH-groepen van MNT.Een optimaal onderdeel van de MNT voor de aanhechting van aanvullende functionele groepen (bijv. een geneesmiddel met een laag molecuulgewicht) is de dragermodule.Deze module bevat twee cysteïnes, die echter niet direct beschikbaar zijn voor modificatie.Om een ​​betere opbrengst van Mal-PEG-FA-aanhechting te verkrijgen, gebruikten we daarom een ​​MNT-variant met een extra cysteïneresidu in plaats van de ligandmodule op de C-terminus van de MNT, omdat ligandmodules van andere vergelijkbare MNT's de functionaliteit van andere modules.15,16 Conjugatie van Mal-PEG-FA aan MNT vergde enige inspanning om de optimale reactieomstandigheden te vinden, waardoor MNT-PEG-FA met een hoge reactieopbrengst werd verkregen.Deze reactie-optimalisatiestappen worden gepresenteerd in het aanvullende materiaal en figuur S1.Het resulterende MNT-PEG-FA werd gekarakteriseerd door twee verschillende methoden.Met behulp van de eerste, niet-reducerende SDS-PAGE, berekenden we de verhouding van MNT gederivatiseerd met één, twee of drie PEG-FA-moleculen en niet-gederivatiseerd MNT en evalueerden we de integriteit van het resulterende MNT-PEG-FA.Het resulterende product van MNT-modificatie met Mal-PEG-FA bezat voornamelijk MNT dat één PEG-FA-molecuul bevat, hoewel de aanwezigheid van MNT-moleculen die zijn gemodificeerd met twee of zelfs drie PEG-FA (Figuur 2A) wijst op gedeeltelijke beschikbaarheid van de twee andere SH -groepen onder de reactieomstandigheden.De tweede methode, spectrofotometrie, werd gebruikt om het gemiddelde aantal FA-moleculen dat aan MNT is gehecht te schatten op basis van de karakteristieke FA-absorptiepiek bij 367 nm, gecorrigeerd voor MNT-absorptie bij deze golflengte.Zowel spectrofotometrische als SDS-PAGE-gelanalysemethoden gaven een vergelijkbare FA-PEG: MNT-verhouding van 1, 5-1, 6.Conjugatie van Alexa Fluor 647 tot MNT-PEG-FA en MNT-PEGVoor daaropvolgende flowcytometrie en confocale laser scanning microscopie studies, hebben we Alexa Fluor 647 succinimidyl ester geconjugeerd aan MNT-PEG-FA of MNT-PEG, resulterend in een gemiddelde van 3,5 Alexa Fluor 647 moleculen gehecht aan MNT-PEG-FA.Flowcytometriestudies van MNT-PEG-FA-Alexa647 internalisatie in FR-positieve cellenMet behulp van flowcytometriestudies op getrypsiniseerde en gewassen cellen, hebben we alleen de geïnternaliseerde fractie van Alexa Fluor 647-gelabeld MNT-PEG-FA beoordeeld.We observeerden significante fluorescentie van HeLa (FR-positieve) cellen die waren geïncubeerd met MNT-PEG-FA-Alexa647 (Figuur 3).De mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) nam toe met een toename van de incubatietijd van 24 tot 48 uur (Figuur 3).Voor verdere vergelijkingen hebben we MFI-waarden van HeLa-cellen geïncubeerd met MNT-PEG-FA-Alexa647 voor elk tijdstip ingesteld op 100%.De MFI was significant verlaagd tot 9,9% na 24 uur en tot 14% na 48 uur met behulp van medium dat vrij 1 mM FA bevat, waarmee de specificiteit van MNT-PEG-FA-Alexa647 internalisatie wordt aangetoond (Figuur 3).De MFI van HeLa-cellen geïncubeerd met ligandvrije controle MNT-PEG-Alexa647 was verlaagd tot 6,6% na 24 uur en tot 8,4% na 48 uur vergeleken met HeLa-cellen geïncubeerd met MNT-PEG-FA-Alexa647, wat aantoont dat conjugatie van FA verbetert de opname van MNT-PEG-FA door tumorcellen.In tegenstelling tot MNT-PEG-FA-Alexa647 was er geen verschil in de MFI van HeLa-cellen die waren geïncubeerd met ligandvrije controle MNT-PEG-Alexa647 in de aanwezigheid of afwezigheid van 1 mM FA, wat niet-specifieke internalisatie van controle MNT-PEG aantoont -Alexa647 zonder FA.Bovendien vertoonden FR-negatieve A549-cellen meer dan 10-voudig verlaagde MFI, wat vergelijkbaar was voor zowel MNT-PEG-FA-Alexa647 als controle-ligandvrij MNT-PEG-Alexa647.Figuur 3 Intracellulaire accumulatie van MNT-PEG-FA gelabeld met Alexa Fluor 647 en gemeten met flowcytometrie.Opmerkingen: (A) Flowcytometriehistogrammen van HeLa (FR-positief) of A549 (FR-negatieve) cellen die zijn geïncubeerd met ofwel 50 nM MNT-PEG-FA-Alexa647 alleen of in aanwezigheid van 1 mM FA of met niet-gerichte controle MNT-PEG-Alexa647, zonder FA alleen of in aanwezigheid van 1 mM FA gedurende 48 uur.(B, C) Gemiddelde fluorescentie-intensiteiten voor HeLa of controle A549-cellen die zijn geïncubeerd met ofwel 50 nM MNT-PEG-FA-Alexa647 alleen of in aanwezigheid van 1 mM FA of met niet-gerichte controle MNT-PEG-Alexa647, zonder FA alleen of in aanwezigheid van 1 mM FA gedurende 24 uur (B) of 48 uur (C).Onbehandelde cellen dienden als autofluorescentiecontroles.Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten van het gemiddelde (n = 3-6).Afkortingen: FA, foliumzuur;MNT's, modulaire nanotransporters;PEG, polyethyleenglycol.Confocale laser scanning microscopie beeldvorming van FR-positieve cellen na incubatie met MNT-PEG-FA-Alexa647Confocale laser scanning microscopie studies uitgevoerd op de vaste FR tot expressie brengende HeLa-cellen (Figuur 4) demonstreert intracellulaire en intranucleaire Alexa Fluor 647 fluorescentie na 48 uur incubatie met MNT-PEG-FA-Alexa647 (Figuur 4A en A′).Omdat MNT-internalisatie en transport naar kernen via het cytoplasma continu van buitenaf plaatsvindt, kunnen we een "momentopname" van de intracellulaire distributie van de MNT waarnemen, waarbij een aanzienlijk deel op zijn weg (bijvoorbeeld in het cytoplasma) naar het doelcompartiment wordt gevangen. – de celkern.Alle rechten voorbehouden.